Se recogieron biopsias duodenales al diagnóstico de niños con EC que seguían una dieta normal con gluten, y de niños sanos. El grupo de niños sanos lo constituían pacientes que estaban siendo evaluados por trastornos funcionales gastrointetsinales no relacionados con la enfermedad celíaca ni el gluten. Todos los sujetos sanos tenían marcadores serológicos de EC negativos y una mucosa normal en la biopsias del intestino delgado (Marsh0)14. Los pacientes con EC tenían tanto marcadores serológicos positivos (anticuerpos antitransglutaminasa tisular IgA, anticuerpos antigliadina deaminada IgG y anticuerpos antiendomisio IgA) como lesiones histológicas en la biopsia duodenal.

El estudio se llevó a cabo conforme a los principios de la Declaración de Helsinki y siguiendo los EEC Good Clinical Practice Guidelines (Guía de Buena Práctica Clínica, documento 111/3976/88, julio de 1990), y dentro de marco legal vigente en España para regular la investigación clínica en seres humanos (Real Decreto 561/1993). El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética del CSIC y por el hospital.

Se obtuvo el consentimiento informado de los padres de los niños incluidos en el estudio. Ningún caso incluido en el estudio había recibido tratamiento antibiótico en los 2 meses previos a la endoscopia. Se tomaron 4 biopsias de la mucosa duodenal de cada paciente. Dos muestras de cada paciente se enviaron para examen histológico empleando la clasificación de Marsh, y otras 2 se congelaron de inmediato tras su obtención y se almacenaron a –20°C hasta su procesamiento para estudio bacteriológico. Estas últimas se suspendieron en 1ml de PBS y se centrifugaron a 1.000g durante 5min.

El ADN total se extrajo de cada muestra mediante el procedimiento descrito por Martínez et al.15 con las modificaciones publicadas por Tapia-Paniagua et al.16. Se trataron 20μl de ADN con 2μl de acetato de sodio 3M y 46μl de isopropanol. Las muestras se centrifugaron a 12.000g durante 6min. Los precipitados de ADN se lavaron con etanol al 70% y centrifugados a 12.000 g durante 6 minutos, posteriormente se dejaron secar y fueron resuspendidos en agua químicamente pura.

Para comparar los patrones de electroforesis en gel con gradiente gradiente desnaturalizante (DGGE) de la microbiota duodenal se amplificó el ADN mediante los cebadores específicos para el ADNr16S del dominio Bacteria (968-GC-F y 1401-R). Estos cebadores se utilizaron para amplificar las regiones V6-V8 del ADNr16S. Las mezclas y las condiciones utilizadas para llevar a cabo la PCR se han descrito previamente12. También se emplearon amplicones específicos para el género Lactobacillus (tabla 1). Las mezclas (50μl) contenían 1,25U de polimerasa Taq (Life Technologies Gaithersburg, MD, EE.UU.), 20mM de Tris-HCl (pH8,5), 50mM de KCl, 3mM de MgCl2, 200μM de cada deoxinucleósido trifosfato, 5pmol de los cebadores, 1μl de ADN molde y agua esterilizada mediante radiación ultravioleta. La PCR se llevó a cabo en un termociclador T1 (Whatman Biometra, Göttingen, Alemania) aplicando un ciclo de 2min a 94°C, 35 ciclos de 30s a 95°C, 40s a 56°C, y 1min a 72°C, y finalmente un ciclo de 5min a 72°C. Las alícuotas (5μl) se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (p/v) que contenía bromuro de etidio.

Los amplicones obtenidos se separaron por DGGE siguiendo las instrucciones de Muyzer et al.17 mediante un sistema Dcode TM (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). La electroforesis se llevó a cabo en gel de poliacrilamida al 8% (37,5:1 acrilamida-bisacrilamida; dimensiones, 200×200×1mm) empleando un gradiente desnaturalizante del 30 al 55% para separar los productos de la PCR. La solución desnaturalizante al 100% contenía 7M de urea y un 40% (v/v) de formamida desionizada. Se añadieron a los geles las muestras de la PCR en alícuotas de 13μl por carril. Se realizó la electroforesis de los geles durante 16h a 85V en tampón TAE 0,5X (20mM tris-acetato [pH7,4], 10mM acetato de sodio, 0,5mM Na2EDTA) a una temperatura constante de 60°C, y a continuación se tiñó con nitrato de plata18.

Los patrones de bandas obtenidos se analizaron mediante el programa FPQuest versión 4.0 (Applied Maths BVBA, Sint-Martens-Latem, Bélgica). Se generó una matriz de similitud para las curvas densitométricas de los patrones de bandas utilizando el coeficiente de Pearson. Posteriormente se agruparon los patrones por similitud mediante la construcción de dendrogramas aplicando el método UPGMA (del inglés, Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean). Para determinar la diversidad estructural de la comunidad microbiana correspondiente a los patrones de bandas de la DGGE se calcularon varios parámetros: a)la riqueza específica (R) se estimó en base al número total de bandas; b)el índice de Shannon (H′) se calculó mediante la función H′=–ΣPi logPi, en la que Pi se define como (ni/N), ni es el área del pico de cada banda y N es la suma de las áreas de intensidad de todas las bandas; c)la riqueza ponderada por el rango (Rr) se calculó como el número total de bandas multiplicado por el porcentaje de gradiente desnaturalizante requerido para describir la diversidad total de la muestra analizada, de acuerdo con la siguiente fórmula: Rr=(N2×Dg), donde N representa el número total de bandas en el patrón, y Dg el gradiente de desnaturalización comprendido entre las bandas primera y última del patrón19.

Para determinar cuáles eran las bacterias principales, se recuperaron para su secuenciación las bandas predominantes de los geles de DGGE mediante puntas de pipeta estériles, introduciéndose en 100μl de agua bidestilada (ddH2O) e incubándose a 4°C hasta el día siguiente. Se emplearon alícuotas de 5μl como molde para amplificar el ADN mediante PCR, siguiendo el procedimiento explicado anteriormente. Los productos se volvieron a someter a DGGE para confirmar sus posiciones y también fueron secuenciados por ciclos con los cebadores 968 sin la pinza GC (5′-AACGCGAAGAACCTTAC-3′), 1401-R y (5′ACG’GCTACCTTGTTACGACTT-3′). La PCR se llevó a cabo en un termociclador T1 (Whatman Biometra, Göttingen, Alemania) aplicando un ciclo a 94°C durante 2min, 28 ciclos a 95°C durante 30s, 56°C durante 40s y 72°C durante 1min, y por último un ciclo a 72°C de 5min. Los productos se purificaron con el kit de purificación Spin Kit PCR (Roche). Los amplicones se secuenciaron en un secuenciador ABI PRISM 377 (Perkin-Elmer). La secuenciación se hizo en ambas direcciones con los cebadores RV-M y M13-47, respectivamente. Las secuencias resultantes (∼500pb) se compararon con las secuencias de las bases de datos de la National Center for Biotechnology Information (NCBI) o la Greengenes DNA sequence database empleando el algoritmo BLAST21. Las secuencias mostraron una similitud con las presentes en la base de datos superior al 97%22.

El análisis de componentes principales (ACP) es un método matemático que emplea una transformación ortogonal para convertir un conjunto de observaciones de variables posiblemente correlacionadas en un conjunto de valores de variables linealmente incorrelacionadas entre sí. Este método ha sido empleado para simplificar patrones de RFLP23. En nuestro estudio se aplicó a la correlación de diferentes parámetros ecológicos (H’, R y Rr) e histológicos y la proporción de ADN de cada especie bacteriana detectada en las muestras de la microbiota intestinal de los pacientes. El ACP se realizó con la ayuda del software XLSTAT versión 4.5 para MS Excel (Addinsoft, España). La influencia de las variables en el ACP se determinó mediante la distancia de cada variable al centro del eje d≥√2/n, donde n es el número de variables. El ADN se cuantificó por medio de la intensidad de las bandas de DGGE.

Las variables se expresaron como media y desviación estándar y el análisis estadístico se llevó a cabo con el software Statistical Package for Social Science for Windows (SPSS) versión 15.0, SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Los índices ecológicos se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis con el software Statgraphics Plus 5.0 (Statgraphics Corporation, Rockville, MD, EE.UU.). La significación estadística se estableció en p≤0,05.

No se encontraron diferencias significativas entre sujetos sanos y pacientes celíacos en la riqueza, la diversidad y en la riqueza ponderada por el rango (tabla 3), aunque estos 3 valores fueron significativamente menores en niños celíacos en comparación con CS cuando se analizó el género Lactobacillus (tabla 3).

También se aplicó un algoritmo de agrupamiento a los patrones de DGGE de la microbiota duodenal. Esto reveló altos porcentajes de similitud intragrupo (98%) en pacientes con histología Marsh3c. El resto de los pacientes mostró una similitud del 80 al 30%, y el grupo no se formó en base a otras características (fig. 1).

Figura 1.

Análisis de agrupamiento de patrones de bandas de DGGE de los grupos bacterianos en la microbiota duodenal de pacientes celíacos (EC) y controles sanos (CS).

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Se hizo un segundo dendrograma empleando exclusivamente los amplicones del género Lactobacillus, que mostró 2 grupos distintos con una similitud del 40% aproximadamente, pero los grupos no se formaron en base a ninguna de las características analizadas (datos no mostrados).

Las bandas de mayor intensidad en los geles de DGGE de las biopsias se secuenciaron y compararon con las referencias de BLAST en base a la relación filogenética con la secuencia parcial de ADNr16S de ∼500pb (tabla 4). En pacientes celíacos, las bandas se asociaban mayoritariamente a géneros como Streptococcus, Bacterioides y la especie E. coli, mientras que en sujetos sanos las bandas predominantes correspondían a Bifidobacterium, Acinetobacter y Lactobacillus. Otros grupos, como Streptococcus (17 al 13%) o Bacteroides (16 al 11%) fueron menos frecuentes.

El ACP mostró que 2 factores (F1 y F2) podían explicar el 83,44% de la varianza encontrada en la microbiota y las demás variables analizadas en pacientes y controles. Cabe destacar que las variables relacionadas con la riqueza, la diversidad y la habitabilidad en el género Lactobacillus cambian de manera inversa a las demás variables empleadas en el F1. Además, el F1 separaba al grupo de CS de los pacientes celíacos, de manera que el F1 puede ser un factor relacionado con la presencia o ausencia de enfermedad (fig. 2).

Figura 2.

ACP aplicado a la composición de la microbiota de las biopsias y los parámetros analizados en pacientes celíacos y controles sanos (CS). Correlación de las variables analizadas y los componentes principales que explican el 83,44% de la varianza. Distribución de sujetos celíacos y controles sanos a lo largo de los ejes F1 y F2.

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