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la hiperplasia de las criptas y la infiltraci&#243;n linfocitaria&#46;</p><p id="par0010" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La EC es un trastorno multifactorial en el que interact&#250;an factores gen&#233;ticos y ambientales&#46; Entre los factores ambientales se encuentran la exposici&#243;n temprana al gluten&#44; la lactancia materna de corta duraci&#243;n&#44; las infecciones intestinales y las alteraciones de la microbiota&#46;</p><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Recientemente la literatura cient&#237;fica ha descrito alteraciones en la composici&#243;n de la microbiota en pacientes cel&#237;acos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0010"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>&#46; Hasta el momento las diferencias en la composici&#243;n de la microbiota y en metabolitos asociados entre pacientes cel&#237;acos y controles sanos &#40;CS&#41; han sido descritos en base a muestras fecales<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0015"><span class="elsevierStyleSup">3&#44;4</span></a>&#46; Tambi&#233;n se ha descrito una mayor diversidad bacteriana y diferencias en varios grupos de bacterias en la microbiota duodenal de pacientes pedi&#225;tricos con EC<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0025"><span class="elsevierStyleSup">5&#8211;7</span></a>&#46; Sin embargo&#44; otros estudios no consiguieron detectar diferencias significativas entre la microbiota de ni&#241;os cel&#237;acos y la de CS<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0040"><span class="elsevierStyleSup">8&#8211;10</span></a>&#46; Cheng et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0050"><span class="elsevierStyleSup">10</span></a> describieron una composici&#243;n similar de la microbiota en ni&#241;os cel&#237;acos y CS&#44; pero observaron diferencias significativas en un perfil subpoblacional de 8 grupos bacterianos a nivel de g&#233;nero que podr&#237;a desempe&#241;ar un papel espec&#237;fico en el trastorno epitelial de la EC&#46;</p><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se han descrito cambios en la microbiota duodenal de pacientes cel&#237;acos adultos y pedi&#225;tricos tanto con enfermedad activa<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0025"><span class="elsevierStyleSup">5&#44;9&#44;11</span></a> como cuando siguen una dieta sin gluten<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0060"><span class="elsevierStyleSup">12</span></a>&#46; Wacklin et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0065"><span class="elsevierStyleSup">13</span></a> encontraron diferencias entre la composici&#243;n y la diversidad de la microbiota intestinal de adultos con s&#237;ntomas intestinales cl&#225;sicos de EC y las de adultos con s&#237;ntomas extraintestinales&#44; indicando que la composici&#243;n de la microbiota residente en la mucosa duodenal de los pacientes difer&#237;a bas&#225;ndose en las manifestaciones de la EC&#46;</p><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El objeto de nuestro estudio era establecer si la microbiota duodenal de los ni&#241;os con EC activa y la de los controles difieren en su composici&#243;n y biodiversidad para explicar las diferencias entre la microbiota de los pacientes pedi&#225;tricos cel&#237;acos y la de los controles sanos&#46;</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0070">Materiales y m&#233;todos</span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">Sujetos</span><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se recogieron biopsias duodenales al diagn&#243;stico de ni&#241;os con EC que segu&#237;an una dieta normal con gluten&#44; y de ni&#241;os sanos&#46; El grupo de ni&#241;os sanos lo constitu&#237;an pacientes que estaban siendo evaluados por trastornos funcionales gastrointetsinales no relacionados con la enfermedad cel&#237;aca ni el gluten&#46; Todos los sujetos sanos ten&#237;an marcadores serol&#243;gicos de EC negativos y una mucosa normal en la biopsias del intestino delgado &#40;Marsh<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0070"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a>&#46; Los pacientes con EC ten&#237;an tanto marcadores serol&#243;gicos positivos &#40;anticuerpos antitransglutaminasa tisular IgA&#44; anticuerpos antigliadina deaminada IgG y anticuerpos antiendomisio IgA&#41; como lesiones histol&#243;gicas en la biopsia duodenal&#46;</p><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El estudio se llev&#243; a cabo conforme a los principios de la Declaraci&#243;n de Helsinki y siguiendo los <span class="elsevierStyleItalic">EEC Good Clinical Practice Guidelines</span> &#40;Gu&#237;a de Buena Pr&#225;ctica Cl&#237;nica&#44; documento 111&#47;3976&#47;88&#44; julio de 1990&#41;&#44; y dentro de marco legal vigente en Espa&#241;a para regular la investigaci&#243;n cl&#237;nica en seres humanos &#40;Real Decreto 561&#47;1993&#41;&#46; El protocolo del estudio fue aprobado por el Comit&#233; de &#201;tica del CSIC y por el hospital&#46;</p><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se obtuvo el consentimiento informado de los padres de los ni&#241;os incluidos en el estudio&#46; Ning&#250;n caso incluido en el estudio hab&#237;a recibido tratamiento antibi&#243;tico en los 2 meses previos a la endoscopia&#46; Se tomaron 4 biopsias de la mucosa duodenal de cada paciente&#46; Dos muestras de cada paciente se enviaron para examen histol&#243;gico empleando la clasificaci&#243;n de Marsh&#44; y otras 2 se congelaron de inmediato tras su obtenci&#243;n y se almacenaron a &#8211;20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C hasta su procesamiento para estudio bacteriol&#243;gico&#46; Estas &#250;ltimas se suspendieron en 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de PBS y se centrifugaron a 1&#46;000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">g</span> durante 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#46;</p></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Extracci&#243;n de ADN</span><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El ADN total se extrajo de cada muestra mediante el procedimiento descrito por Mart&#237;nez et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0075"><span class="elsevierStyleSup">15</span></a> con las modificaciones publicadas por Tapia-Paniagua et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0080"><span class="elsevierStyleSup">16</span></a>&#46; Se trataron 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de ADN con 2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de acetato de sodio 3M y 46<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de isopropanol&#46; Las muestras se centrifugaron a 12&#46;000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">g</span> durante 6<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#46; Los precipitados de ADN se lavaron con etanol al 70&#37; y centrifugados a 12&#46;000 g durante 6 minutos&#44; posteriormente se dejaron secar y fueron resuspendidos en agua qu&#237;micamente pura&#46;</p></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0085">PCR-electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante</span><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para comparar los patrones de electroforesis en gel con gradiente gradiente desnaturalizante &#40;DGGE&#41; de la microbiota duodenal se amplific&#243; el ADN mediante los cebadores espec&#237;ficos para el ADNr<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>16S del dominio Bacteria &#40;968-GC-F y 1401-R&#41;&#46; Estos cebadores se utilizaron para amplificar las regiones V6-V8 del ADNr<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>16S&#46; Las mezclas y las condiciones utilizadas para llevar a cabo la PCR se han descrito previamente<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0060"><span class="elsevierStyleSup">12</span></a>&#46; Tambi&#233;n se emplearon amplicones espec&#237;ficos para el g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a>&#41;&#46; Las mezclas &#40;50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l&#41; conten&#237;an 1&#44;25<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>U de polimerasa Taq &#40;Life Technologies Gaithersburg&#44; MD&#44; EE&#46;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>UU&#46;&#41;&#44; 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM de Tris-HCl &#40;pH<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>8&#44;5&#41;&#44; 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM de KCl&#44; 3<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM de MgCl<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#44; 200<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M de cada deoxinucle&#243;sido trifosfato&#44; 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>pmol de los cebadores&#44; 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de ADN molde y agua esterilizada mediante radiaci&#243;n ultravioleta&#46; La PCR se llev&#243; a cabo en un termociclador T1 &#40;Whatman Biometra&#44; G&#246;ttingen&#44; Alemania&#41; aplicando un ciclo de 2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 94<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#44; 35 ciclos de 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>s a 95<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#44; 40<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>s a 56<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#44; y 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 72<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#44; y finalmente un ciclo de 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 72<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#46; Las al&#237;cuotas &#40;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l&#41; se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1&#44;5&#37; &#40;p&#47;v&#41; que conten&#237;a bromuro de etidio&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los amplicones obtenidos se separaron por DGGE siguiendo las instrucciones de Muyzer et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0085"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a> mediante un sistema Dcode TM &#40;Bio-Rad Laboratories&#44; Hercules&#44; California&#41;&#46; La electroforesis se llev&#243; a cabo en gel de poliacrilamida al 8&#37; &#40;37&#44;5&#58;1 acrilamida-bisacrilamida&#59; dimensiones&#44; 200<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#215;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>200<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#215;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm&#41; empleando un gradiente desnaturalizante del 30 al 55&#37; para separar los productos de la PCR&#46; La soluci&#243;n desnaturalizante al 100&#37; conten&#237;a 7<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M de urea y un 40&#37; &#40;v&#47;v&#41; de formamida desionizada&#46; Se a&#241;adieron a los geles las muestras de la PCR en al&#237;cuotas de 13<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l por carril&#46; Se realiz&#243; la electroforesis de los geles durante 16<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h a 85<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>V en tamp&#243;n TAE 0&#44;5X &#40;20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM tris-acetato &#91;pH<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>7&#44;4&#93;&#44; 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM acetato de sodio&#44; 0&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM Na<span class="elsevierStyleInf">2</span>EDTA&#41; a una temperatura constante de 60<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#44; y a continuaci&#243;n se ti&#241;&#243; con nitrato de plata<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0090"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0090">An&#225;lisis de patrones de DGGE</span><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los patrones de bandas obtenidos se analizaron mediante el programa FPQuest versi&#243;n 4&#46;0 &#40;Applied Maths BVBA&#44; Sint-Martens-Latem&#44; B&#233;lgica&#41;&#46; Se gener&#243; una matriz de similitud para las curvas densitom&#233;tricas de los patrones de bandas utilizando el coeficiente de Pearson&#46; Posteriormente se agruparon los patrones por similitud mediante la construcci&#243;n de dendrogramas aplicando el m&#233;todo UPGMA &#40;del ingl&#233;s&#44; Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean&#41;&#46; Para determinar la diversidad estructural de la comunidad microbiana correspondiente a los patrones de bandas de la DGGE se calcularon varios par&#225;metros&#58; a&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>la riqueza espec&#237;fica &#40;R&#41; se estim&#243; en base al n&#250;mero total de bandas&#59; b&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>el &#237;ndice de Shannon &#40;H&#8242;&#41; se calcul&#243; mediante la funci&#243;n H&#8242;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#8211;&#931;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>Pi log<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>Pi&#44; en la que Pi se define como &#40;ni&#47;N&#41;&#44; ni es el &#225;rea del pico de cada banda y N es la suma de las &#225;reas de intensidad de todas las bandas&#59; c&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>la riqueza ponderada por el rango &#40;Rr&#41; se calcul&#243; como el n&#250;mero total de bandas multiplicado por el porcentaje de gradiente desnaturalizante requerido para describir la diversidad total de la muestra analizada&#44; de acuerdo con la siguiente f&#243;rmula&#58; Rr<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#40;N<span class="elsevierStyleSup">2</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#215;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>D<span class="elsevierStyleInf">g</span>&#41;&#44; donde N representa el n&#250;mero total de bandas en el patr&#243;n&#44; y D<span class="elsevierStyleInf">g</span> el gradiente de desnaturalizaci&#243;n comprendido entre las bandas primera y &#250;ltima del patr&#243;n<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0095"><span class="elsevierStyleSup">19</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0095">Secuenciaci&#243;n de las bandas de DGGE</span><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para determinar cu&#225;les eran las bacterias principales&#44; se recuperaron para su secuenciaci&#243;n las bandas predominantes de los geles de DGGE mediante puntas de pipeta est&#233;riles&#44; introduci&#233;ndose en 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de agua bidestilada &#40;ddH<span class="elsevierStyleInf">2</span>O&#41; e incub&#225;ndose a 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C hasta el d&#237;a siguiente&#46; Se emplearon al&#237;cuotas de 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l como molde para amplificar el ADN mediante PCR&#44; siguiendo el procedimiento explicado anteriormente&#46; Los productos se volvieron a someter a DGGE para confirmar sus posiciones y tambi&#233;n fueron secuenciados por ciclos con los cebadores 968 sin la pinza GC &#40;5&#8242;-AACGCGAAGAACCTTAC-3&#8242;&#41;&#44; 1401-R y &#40;5&#8242;ACG&#8217;GCTACCTTGTTACGACTT-3&#8242;&#41;&#46; La PCR se llev&#243; a cabo en un termociclador T1 &#40;Whatman Biometra&#44; G&#246;ttingen&#44; Alemania&#41; aplicando un ciclo a 94<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#44; 28 ciclos a 95<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>s&#44; 56<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 40<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>s y 72<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#44; y por &#250;ltimo un ciclo a 72<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C de 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#46; Los productos se purificaron con el kit de purificaci&#243;n Spin Kit PCR &#40;Roche&#41;&#46; Los amplicones se secuenciaron en un secuenciador ABI PRISM 377 &#40;Perkin-Elmer&#41;&#46; La secuenciaci&#243;n se hizo en ambas direcciones con los cebadores RV-M y M13-47&#44; respectivamente&#46; Las secuencias resultantes &#40;&#8764;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>pb&#41; se compararon con las secuencias de las bases de datos de la <span class="elsevierStyleItalic">National Center for Biotechnology Information</span> &#40;NCBI&#41; o la <span class="elsevierStyleItalic">Greengenes DNA sequence database</span> empleando el algoritmo BLAST<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0105"><span class="elsevierStyleSup">21</span></a>&#46; Las secuencias mostraron una similitud con las presentes en la base de datos superior al 97&#37;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0110"><span class="elsevierStyleSup">22</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0100">An&#225;lisis de componentes principales</span><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El an&#225;lisis de componentes principales &#40;ACP&#41; es un m&#233;todo matem&#225;tico que emplea una transformaci&#243;n ortogonal para convertir un conjunto de observaciones de variables posiblemente correlacionadas en un conjunto de valores de variables linealmente incorrelacionadas entre s&#237;&#46; Este m&#233;todo ha sido empleado para simplificar patrones de RFLP<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0115"><span class="elsevierStyleSup">23</span></a>&#46; En nuestro estudio se aplic&#243; a la correlaci&#243;n de diferentes par&#225;metros ecol&#243;gicos &#40;H&#8217;&#44; R y Rr&#41; e histol&#243;gicos y la proporci&#243;n de ADN de cada especie bacteriana detectada en las muestras de la microbiota intestinal de los pacientes&#46; El ACP se realiz&#243; con la ayuda del software XLSTAT versi&#243;n 4&#46;5 para MS Excel &#40;Addinsoft&#44; Espa&#241;a&#41;&#46; La influencia de las variables en el ACP se determin&#243; mediante la distancia de cada variable al centro del eje d<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#8805;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#8730;2&#47;n&#44; donde n es el n&#250;mero de variables&#46; El ADN se cuantific&#243; por medio de la intensidad de las bandas de DGGE&#46;</p></span><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0105">An&#225;lisis estad&#237;stico</span><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las variables se expresaron como media y desviaci&#243;n est&#225;ndar y el an&#225;lisis estad&#237;stico se llev&#243; a cabo con el software <span class="elsevierStyleItalic">Statistical Package for Social Science for Windows</span> &#40;SPSS&#41; versi&#243;n 15&#46;0&#44; SPSS Inc&#46;&#44; Chicago&#44; IL&#44; EE&#46;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>UU&#46;&#41;&#46; Los &#237;ndices ecol&#243;gicos se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis con el software Statgraphics Plus 5&#46;0 &#40;Statgraphics Corporation&#44; Rockville&#44; MD&#44; EE&#46;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>UU&#46;&#41;&#46; La significaci&#243;n estad&#237;stica se estableci&#243; en p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#8804;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;05&#46;</p></span></span><span id="sec0050" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0110">Resultados</span><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se recogieron espec&#237;menes mediante biopsia duodenal de 11 ni&#241;os que segu&#237;an una dieta con gluten al diagn&#243;stico de EC y de 6 ni&#241;os sanos &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0010">tabla 2</a>&#41;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0010"></elsevierMultimedia><span id="sec0055" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0115">Composici&#243;n y diversidad de la microbiota por DGGE</span><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">No se encontraron diferencias significativas entre sujetos sanos y pacientes cel&#237;acos en la riqueza&#44; la diversidad y en la riqueza ponderada por el rango &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0015">tabla 3</a>&#41;&#44; aunque estos 3 valores fueron significativamente menores en ni&#241;os cel&#237;acos en comparaci&#243;n con CS cuando se analiz&#243; el g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0015">tabla 3</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0015"></elsevierMultimedia><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Tambi&#233;n se aplic&#243; un algoritmo de agrupamiento a los patrones de DGGE de la microbiota duodenal&#46; Esto revel&#243; altos porcentajes de similitud intragrupo &#40;98&#37;&#41; en pacientes con histolog&#237;a Marsh<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>3c&#46; El resto de los pacientes mostr&#243; una similitud del 80 al 30&#37;&#44; y el grupo no se form&#243; en base a otras caracter&#237;sticas &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se hizo un segundo dendrograma empleando exclusivamente los amplicones del g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span>&#44; que mostr&#243; 2 grupos distintos con una similitud del 40&#37; aproximadamente&#44; pero los grupos no se formaron en base a ninguna de las caracter&#237;sticas analizadas &#40;datos no mostrados&#41;&#46;</p><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las bandas de mayor intensidad en los geles de DGGE de las biopsias se secuenciaron y compararon con las referencias de BLAST en base a la relaci&#243;n filogen&#233;tica con la secuencia parcial de ADNr<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>16S de &#8764;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>pb &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0020">tabla 4</a>&#41;&#46; En pacientes cel&#237;acos&#44; las bandas se asociaban mayoritariamente a g&#233;neros como <span class="elsevierStyleItalic">Streptococcus</span>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">Bacterioides</span> y la especie <span class="elsevierStyleItalic">E&#46; coli</span>&#44; mientras que en sujetos sanos las bandas predominantes correspond&#237;an a <span class="elsevierStyleItalic">Bifidobacterium&#44; Acinetobacter</span> y <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus&#46;</span> Otros grupos&#44; como <span class="elsevierStyleItalic">Streptococcus</span> &#40;17 al 13&#37;&#41; o <span class="elsevierStyleItalic">Bacteroides</span> &#40;16 al 11&#37;&#41; fueron menos frecuentes&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0020"></elsevierMultimedia><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El ACP mostr&#243; que 2 factores &#40;F1 y F2&#41; pod&#237;an explicar el 83&#44;44&#37; de la varianza encontrada en la microbiota y las dem&#225;s variables analizadas en pacientes y controles&#46; Cabe destacar que las variables relacionadas con la riqueza&#44; la diversidad y la habitabilidad en el g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> cambian de manera inversa a las dem&#225;s variables empleadas en el F1&#46; Adem&#225;s&#44; el F1 separaba al grupo de CS de los pacientes cel&#237;acos&#44; de manera que el F1 puede ser un factor relacionado con la presencia o ausencia de enfermedad &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig&#46; 2</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia></span></span><span id="sec0060" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0120">Discusi&#243;n</span><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">No se encontraron diferencias significativas en la diversidad estructural de la comunidad microbiana correspondiente a los patrones de bandas de DGGE entre pacientes cel&#237;acos y controles sanos&#46; El estudio de DGGE con cebadores universales no mostr&#243; una mayor diversidad bacteriana en la microbiota del intestino delgado de pacientes con EC&#44; pero los &#237;ndices ecol&#243;gicos &#40;H&#8217;&#44; R y Rr&#41; fueron significativamente m&#225;s bajos en cel&#237;acos que en CS cuando se analiz&#243; el g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> por separado&#46;</p><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Nadal et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0025"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a> llevaron a cabo an&#225;lisis bacteriol&#243;gicos de espec&#237;menes de biopsias duodenales realizadas a pacientes pedi&#225;tricos con EC&#46; Sus resultados mostraron que los pacientes con enfermedad activa ten&#237;an un n&#250;mero total de bacterias significativamente mayor&#44; sobre todo de bacterias gramnegativas&#44; en comparaci&#243;n con pacientes asintom&#225;ticos y sujetos sanos&#59; y que la raz&#243;n de <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus-Bifidobacterium</span> entre <span class="elsevierStyleItalic">Bacteroides-Escherichia coli</span> era m&#225;s baja en pacientes cel&#237;acos&#46; Nistal et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0045"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a> analizaron la secuenciaci&#243;n del gen ARNr<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>16S bacteriano del ADN extra&#237;do de biopsias duodenales y mostraron que la diversidad de la microbiota duodenal difer&#237;a de manera significativa entre adultos cel&#237;acos tratados y no tratados&#46;</p><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En nuestro estudio&#44; los pacientes con lesiones Marsh<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>3c se agrupaban por separado en el ACP de los patrones de DGGE&#46; El resto de los pacientes que ten&#237;an histolog&#237;as Marsh<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>3a y Marsh<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>3b y un caso con Marsh<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>2 compart&#237;an una microbiota diferente en comparaci&#243;n con los pacientes con Marsh<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>3c&#44; que estaban agrupados m&#225;s estrechamente&#46; Esto sugiere que la composici&#243;n de la microbiota duodenal variaba en funci&#243;n del grado de da&#241;o intestinal&#46;</p><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Es probable que las condiciones del medio ambiente intestinal en casos de atrofia vellositaria grave causen cambios profundos en la comunidad microbiana&#46; Puede que algunos de los cambios en la composici&#243;n de la microbiota duodenal se deban a las consecuencias del patr&#243;n inflamatorio destructivo&#44; lo que es m&#225;s evidente en la atrofia vellositaria duodenal m&#225;s avanzada&#46; En estos casos el efecto inflamatorio del gluten puede incrementar a&#250;n m&#225;s la activaci&#243;n de la inflamaci&#243;n intestinal que resulta del patr&#243;n destructivo de lesi&#243;n atr&#243;fica asociado al tipo Marsh<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>3c&#46; Podr&#237;a pensarse que la atrofia extrema de la mucosa duodenal en la EC no tratada&#44; del tipo Marsh<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>3c&#44; promueve una colonizaci&#243;n similar de la mucosa en estos pacientes&#46;</p><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Har&#225;n falta m&#225;s estudios para entender la interacci&#243;n microbiota-hu&#233;sped y desentra&#241;ar la relevancia de microbiotas espec&#237;ficas para determinar si son &#250;nicamente consecuencia de la EC o si est&#225;n involucradas en la variabilidad y en distintos grados de enteropat&#237;a en esta enfermedad&#46; A este respecto&#44; recientemente se han asociado alteraciones en la microbiota&#44; como la reducci&#243;n de la riqueza microbiana&#44; con la persistencia de s&#237;ntomas en pacientes cel&#237;acos tratados<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0120"><span class="elsevierStyleSup">24</span></a>&#46;</p><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Esperamos que en el futuro la investigaci&#243;n encuentre marcadores bacteriol&#243;gicos en la microbiota duodenal de pacientes cel&#237;acos por razones de diagn&#243;stico y tratamiento&#46;</p></span><span id="sec0065" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0125">Conflicto de intereses</span><p id="par0140" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran no tener ning&#250;n conflicto de intereses&#46;</p></span></span>"
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top" style="border-bottom: 2px solid black">Tama&#241;o del producto &#40;pb&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">AGCAGTAGGGAATCTTCCA<br>GCclamp-ATTYCACCGCT ACACATG&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0020"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">p&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">N&#250;mero&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">11&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">6&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Media &#40;DE&#41; edad &#40;a&#241;os&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">5&#44;0 &#40;3&#44;4&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">8&#44;8 &#40;3&#44;1&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Sexo &#40;masculino&#47;femenino&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">4&#47;7&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">3&#47;3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Anticuerpos antitransglutaminasa tisular IgA positivos&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">11&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">0&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Anticuerpos antigliadina deaminada IgG positivos&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">11&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">0&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Anticuerpos antiendomisio IgA positivos&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">11&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">0&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Biopsia duodenal&#58; clasificaci&#243;n de Marsh &#40;n&#250;mero de casos&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Marsh 2 &#40;1&#41;<br>Marsh 3a &#40;2&#41;<br>Marsh 3b &#40;2&#41;<br>Marsh 3c &#40;6&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Marsh 0 &#40;6&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr></tbody></table>
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                  \t\t\t\t" class=""><thead title="thead"><tr title="table-row"><th class="td" title="table-head  " align="" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Riqueza&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Diversidad&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Riqueza ponderada por el rango&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">EC</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">22&#44;1 &#177; 5&#44;04&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">2&#44;91 &#177; 0&#44;2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">100&#44;36 &#177; 47&#44;44&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">CS</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">19&#44;87 &#177; 5&#44;1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">2&#44;50 &#177; 0&#44;29&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">74&#44;38 &#177; 37&#44;38&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " colspan="4" align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleVsp" style="height:0.5px"></span></td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " colspan="4" align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">G&#233;nero</span> Lactobacillus <span class="elsevierStyleItalic">en biopsias</span></td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>EC&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">6 &#177; 2<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005"><span class="elsevierStyleSup">&#42;</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">1&#44;5 &#177; 0&#44;2<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005"><span class="elsevierStyleSup">&#42;</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">9 &#177; 1<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005"><span class="elsevierStyleSup">&#42;</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>CS&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">15 &#177; 3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">2&#44;2 &#177; 0&#44;2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">56&#44;25 &#177; 2&#44;25&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr></tbody></table>
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                  \t\t\t\t" class=""><thead title="thead"><tr title="table-row"><th class="td" title="table-head  " align="" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">CS &#40;&#37;&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">EC &#40;&#37;&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">13&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">7&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">Streptococcus</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">13&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">17&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">Bacteroides</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">11&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">16&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">Acinetobacter</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">10&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">0&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">E&#46; coli</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">10&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">16&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">Bifidobacterium &#40;B&#46; brevis&#44; B&#46; bifidum&#44; B&#46; lactis&#41;</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">10&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">5&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">Clostridium &#40;C&#46; coccoides&#41;</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">9&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">8&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">Eubacterium</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">9&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">7&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">No identificados&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">9&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">16&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">No cultivados&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">6&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">8&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr></tbody></table>
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