Introducción
La hipercolesterolemia durante la niñez es el principal factor para el desarrollo de arteriosclerosis en la edad adulta. La hipercolesterolemia familiar (HF) es una alteración hereditaria autosómica dominante de los receptores de lipoproteínas de baja densidad (LDL), caracteriza por concentraciones plasmáticas elevadas de colesterol LDL (c-LDL) y colesterol total. La clínica de la HF heterozigótica también incluye alteraciones en la distribución de la grasa corporal, niveles bajos en plasma de factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF-1), respuesta alterada a los triglicéridos, trastornos de coagulación y un riesgo significativamente superior de desarrollar complicaciones cardiovasculares tempranas 1. Uno de los primeros signos de arteriosclerosis es la presencia de disfunción endotelial, que da lugar a una disminución de la distensibilidad vascular 2. Este empeoramiento de la capacidad de dilatación vascular con el flujo sanguíneo es más pronunciada en niños afectados de HF cuyos padres tienen una historia familiar de enfermedad cardiovascular prematura 3. La presencia de marcadores bioquímicos de inflamación (citocinas, moléculas de adhesión, proteína C reactiva [CRP], inhibidores del óxido nítrico [NO], etc.) tienen valor predictivo sobre el riesgo cardiovascular 4.
Existe el consenso de que la intervención terapéutica en niños afectados de HF debe ser empezada a una edad temprana. Las guías del American National Cholesterol Education Program sugieren una dieta apropiada, y que el comienzo de la terapia con fármacos debe ser valorado a partir de los 10 años de edad si los valores de c-LDL ≥ 190 mg/dl, o ≥ 158 mg/dl en presencia de otros factores de riesgo cardiovascular, como historia familiar de enfermedad cardiovascular prematura. Las estatinas son los fármacos más eficientes, y su acción beneficiosa se produce tanto por su capacidad para disminuir las concentraciones de colesterol, como por sus efectos antioxidantes 5,6. Recientemente, se ha puesto de manifiesto el potencial valor terapéutico de las vitaminas antioxidantes para la protección contra la aterosclerosis 7,8.
El objetivo del presente trabajo es la evaluación del efecto de la administración de las vitaminas C y E sobre la dislipemia, composición de los ácidos grasos y los marcadores bioquímicos de inflamación en niños afectados de hipercolesterolemia familiar heterozigótica.
Pacientes y métodos
Pacientes
El estudio se realizó en el Hospital de Cruces de Bilbao y La Fe de Valencia. Participaron en el estudio 40 niños de ambos sexos afectados de hipercolesterolemia familiar, que se caracterizaba por tener valores de c-LDL > 130 mg/dl, y uno de los padres diagnosticado con la enfermedad. El criterio de inclusión comprendía solamente a niños entre 2 y 18 años de edad con valores de c-LDL > 160 mg/dl, peso corporal situado entre los percentiles 10-95, ausencia de síntomas clínicos previos a la terapia, y uno de los padres obligatoriamente afectado por la enfermedad. El criterio de exclusión era el diagnóstico de HF homozigótica o la incapacidad de asegurar el seguimiento clínico.
Este estudio fue revisado y aprobado por el comité ético del Hospital, y además se obtuvo consentimiento informado de los niños o los tutores. Los procedimientos seguidos estaban de acuerdo con las normas éticas del comité de investigación y de la declaración de Helsinki de 1975, con la revisión de octubre de 2000.
Protocolo del estudio
Se realizó un ensayo aleatorizado longitudinal. La duración del estudio fue de un año. Todos los niños incluidos en el ensayo siguieron una intervención dietética de acuerdo con las guías National Cholesterol Education Program (NCEP-1) durante un período mínimo de 6 meses. Después de este período, y manteniendo el mismo tipo de dieta, se aleatorizó a los pacientes en 2 grupos. El primer grupo (7 niños y 14 niñas), denominado V, con una mediana de edad de 10 años (rango: 5-16 años), recibió terapia con vitaminas (vitamina C, 500 mg dos veces al día y vitamina E, 400 U/día). Un segundo grupo (8 niños y 11 niñas), denominado C, con una mediana de edad de 10 años (rango: 5-12 años), no recibió ninguna terapia con vitaminas.
Métodos
Las determinaciones bioquímicas se realizaron en sangre extraída por la mañana en ayunas. Las muestras de sangre se enfriaron en un baño de hielo y se centrifugaron inmediatamente a 1.000 g durante 5 min a 4 °C. El plasma se almacenó en alícuotas a 30 °C hasta la realización de los análisis, normalmente al cabo de pocos días.
El colesterol total y los triglicéridos se determinaron por métodos colorímetros enzimáticos. El colesterol de las lipoproteínas de alta densidad (c-HDL) se midió en el sobrenadante tras la precipitación de las lipoproteínas apo B (quilomicrones), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y LDL con ácido fosfotungsténico e iones de magnesio. Las lipoproteínas A1 y B se determinaron mediante inmunoturbidimetría, y los valores de c-LDL se calcularon aplicando la fórmula de Friedelwald.
Por otra parte, la glucosa y la insulina se midieron utilizando técnicas normalizadas de laboratorio. El índice HOMA de resistencia a la insulina se calculó mediante la fórmula siguiente: glucemia (mg/dl)/18 x insulinemia (μU/ml)/22,5. Este índice posee una buena correlación con el método utilizado normalmente para la medida de resistencia a la insulina, mediante la técnica de clamp euglucémico-hiperinsulinémico.
La actividad del inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1) en plasma se determinó mediante un ensayo cromogénico (PAI-Chromogen - Diagnostica Stago®). El valor de referencia para los niños españoles es de 8 ± 8 (mediana 5) U/ml. En nuestro laboratorio, el percentil 97 en niños normales se estableció en 20 U/ml. La CRP se determinó mediante nefelometría realzada con látex (NA latex CRO, Behring). Más del 90 % de los niños normales poseían valores por debajo del límite de detección de 2,1 mg/l.
La vitamina E, α-tocoferol, se separó del plasma desproteinizado mediante extracción con hexano, utilizando acetato de tocoferol como patrón interno (Sigma). La técnica de análisis empleada fue la cromatografía en fase líquida de alta resolución (Agilent Technologies 1100 Series, CA, USA) con detección fotométrica (294 nm) utilizando metanol a un flujo de 1,1 ml/min como fase móvil y una columna C18 Nucleosil 15 x 0,4 cm y 5 μm de diámetro de partícula (Teknokroma).
La concentración en suero de molécula de adhesión vascular tipo 1 (VCAM-1) soluble (sCD 106) se determinó mediante un método de análisis de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) utilizando anticuerpos monoclonales.
Los ácidos grasos plasmáticos, una vez extraídos del plasma con tolueno-metanol (4:1, v:v), se transmetilaron según Lepage y Roy 9, usando ácido tridecanoico como patrón interno. Los ésteres metílicos de los ácidos grasos se separaron y cuantificaron utilizando un cromatógrafo de gases Hewlett Packard GC 5890 con detector de ionización de llama. La columna capilar utilizada fue SP 2330 (30 m x 0,25 mm, 0,20 mm) (Supelco Company, Bellefonte, PA, USA). La temperatura inicial del horno fue 80 °C, se mantuvo durante 1 min. Después se aumentó hasta 140 °C a una velocidad de 50 °C/min, y posteriormente hasta 190 °C a 5 °C/min, manteniéndose durante 5 min a esa temperatura. Finalmente se aumentó hasta 215 °C a la misma velocidad y se mantuvo isotérmicamente durante 15 min. La temperatura del inyector y el detector fue 250 °C. El gas portador fue helio a una presión de 0,5 bares. La identificación de los ácidos grasos se realizó por comparación con patrones comerciales (Nu Chek, Elysian, MN, USA) y la cuantificación se llevó a cabo mediante integración electrónica.
Los resultados de los ácidos grasos se expresaron como porcentaje en peso. Se agruparon en saturados (AGS) (14:0, 16:0, 17:0, 18:0, 22:0 y 24:0), monoinsaturados (AGMI) (14:1 ω-9, 16:1 ω -7, 18:1 ω-9 y 24:1 ω-9), poliinsaturados ω-6 (AGPI ω-6) (18:2 ω-6, 18:3 ω-6, 20:3 ω-6, 20:4 ω-6, 22:4 ω-6 y 22:5 ω-6), poliinsaturados de larga cadena v-6 (LCP ω-6) (20:3 ω-6, 20:4 ω-6, 22:4 ω-6 y 22:5 ω-6), AGPI ω-3 (18:3 ω-3, 20:5 ω-3, 22:5 ω-3 y 22:6 ω-3) y LCP ω-3 (20:5 ω-3, 22:5 ω-3 y 22:6 ω-3). El cociente producto/precursor se utilizó para calcular la actividad de las enzimas involucradas en el metabolismo de los ácidos grasos: Δ6-desaturasa (18:3 ω-6/18:2 ω-6), y Δ5-desaturasa (20:4 ω-6/20:3 ω-6). Se determinó el índice de deficiencia en ácidos grasos esenciales mediante el cociente 20:3 v-9 (ácido Mead)/20:4 ω-6 (ácido araquidónico).
Análisis estadístico
La asignación aleatoria del tratamiento se realizó con el programa C4-SDP. El análisis estadístico fue llevado a cabo utilizando el programa estadístico SPSS Versión 9.0.1. Los resultados fueron expresados como medias ± desviación estándar (DE). La significación estadística se estableció utilizando el test de la t de Student. Se evaluó la distribución de normalidad y homogeneidad de las varianzas entre los grupos para todas las variables (test de Levene y Shaphiro-Wilk). Si la distribución no era normal, se realizó una transformación logarítmica, siendo con posterioridad los resultados retransformados, expresándose como medias geométricas. Un modelo general lineal univariante fue utilizado para controlar las diferencias de los niveles basales, que a pesar de la aleatorización, existía en algunas variables entre los grupos que habían tomado vitaminas o placebo. Las diferencias se consideraron significativas si el valor de p < 0,05.
Resultados
Parámetros bioquímicos plasmáticos
En la tabla 1 se muestran los valores plasmáticos iniciales y finales para el perfil lipídico, VCAM, CRP, insulina, índice HOMA, PAI-1 y vitamina E. Al comienzo del estudio, la única diferencia entre grupos era la concentración de apolipoproteína B, que era significativamente superior en el grupo V (150,6 ± 28,1 mg/dl) que en el grupo C (132,6 ± 22,8 mg/dl; p < 0,05). Al final del estudio, los pacientes del grupo V mostraron un descenso significativo en la concentración de apolipoproteína B (150,6 ± 28,1 frente a 138,5 ± 24,4; p < 0,05). Además, el grado de cambio fue diferente en el grupo V (10,73 ± 16,62 mg/dl) que en el grupo C (3,10 ± 15,77 mg/dl; p < 0,012).
Composición de los ácidos grasos plasmáticos
En la tabla 2 se muestra el perfil de ácidos grasos inicial y final. Al comienzo del estudio, no se observan diferencias significativas entre los valores de los grupos V y C. Los valores finales mostraron un aumento significativo en las concentraciones plasmáticas de ácido linoleico (18:2 ω-6) en el grupo V (33,3 ± 4,10 frente a 34,42 ± 3,48 %; p < 0,05). Además, el grado de cambio fue diferente en el grupo V (1,42 ± 2,52) que en el grupo C (0,91 ± 3,85; p < 0,04).
Los valores de ácido Mead (20:3 ω-9) fueron significativamente inferiores al final del estudio en el grupo V (0,10 ± 0,02 %) que en el grupo C (0,14 ± 0,05 %; p < 0,01). Este cambio inducía un descenso significativo en el índice de deficiencia de ácidos grasos esenciales (ácido Mead, 20:3 ω-9/ácido araquidónico, 20:4 ω-6) en el grupo que recibía vitaminas.
Modelo general lineal
Utilizando un modelo general lineal (tabla 3), se demostró que las variaciones entre los valores iniciales y finales del ácido linoleico (18:2 ω-6), ácido Mead (20:3 ω-9) y el cociente ácido Mead/ácido araquidónico (20:3 ω-9/20:4 ω-6) que se observaron en el grupo V son debidas solamente a la administración de vitaminas (dando un valor de 1 para los sujetos V y 0 para los pacientes C). La terapia con vitaminas explica el 29, 11 y 15 % de la variación observada, respectivamente. El cambio entre los valores iniciales de apolipoproteína B dependía exclusivamente de los valores iniciales, sin ninguna influencia de las vitaminas antioxidantes.
Discusión
La dieta baja en grasas recomendada a los niños con HF, en consonancia con las guías NCEP-1 (ingesta de grasa saturada, monoinsaturada y poliinsaturada alrededor del 10 % de las calorías totales) puede mejorar el perfil lipídico plasmático, con un descenso moderado del c-LDL, pero sus efectos en la función endotelial son limitados 10.
Engler et al 11 han comprobado que las vitaminas C y E son capaces de restaurar la función endotelial, sin efectos aparentes en los valores plasmáticos de CRP.
El presente trabajo presenta por primera vez los efectos de la terapia con vitaminas antioxidantes sobre las moléculas de adhesión y la composición de los ácidos grasos en niños con HF. La terapia con vitaminas antioxidantes no influyó significativamente en los lípidos plasmáticos, marcadores de inflamación o moléculas de adhesión, todos ellos factores involucrados en la patogénesis de la arteriosclerosis 12. En este sentido, nuestros resultados corroboran plenamente los hallazgos de un estudio previo que también mostraba que la suplementación a largo plazo con vitaminas E y C no tiene efectos detectables sobre los marcadores de la inflamación en pacientes sanos 13.
Un hallazgo importante que se menciona era el aumento significativo de los valores plasmáticos de ácido linoleico observados en niños que reciben terapia con vitaminas. La composición de los ácidos grasos plasmáticos refleja la ingesta de grasa de la dieta, siendo así en especial en el caso del ácido linoleico 14. No se observaron variaciones significativas entre grupos en el tipo de dieta, por lo que se puede concluir que los valores plasmáticos de ácido linoleico, como se demuestra por medio de análisis de regresión univariante, estaban fuertemente influenciados por la terapia con vitaminas. Sin embargo, la administración de vitaminas antioxidantes solamente explicaba el 29 % de la variación observada, y otros factores tanto endógenos como exógenos pueden también tener un papel importante. Un factor de confusión es que la composición de ácidos grasos plasmáticos se presenta como porcentajes de ácidos grasos totales, por lo tanto un cambio en una dirección de un ácido graso específico será reflejado por su correspondiente cambio en otros ácidos grasos 15.
Nuestros datos pueden tener consecuencias clínicas favorables, ya que se conoce que un incremento en el contenido plasmático de ácido linoleico está asociado a un riesgo menor de padecer un infarto de miocardio, cáncer o diabetes tipo 2 16,17. Los pacientes de mediana edad con proporciones de ácido linoleico plasmático, ácidos grasos v-6, y especialmente AGPI en el tercil superior de la normalidad tienen hasta tres veces menos riesgo de muerte por enfermedad cardiovascular que los que tienen valores en el tercil inferior 18.
La insulinemia y glucemia en ayunas, índice de masa corporal (IMC) y la toma de alcohol y tabaco también se asocian con el perfil plasmático de ácidos grasos, y esta asociación es, al menos en parte, independiente de la ingesta dietaria de ácidos grasos 19. Tal y como se muestra en el presente estudio, los posibles efectos beneficiosos de las vitaminas antioxidantes parecen ser independientes de una mejora en la resistencia a la insulina, como se deduce del IMC, la insulinemia en ayunas y el índice HOMA.
El efecto limitado de la vitamina E y otros antioxidantes orales para reducir una aterosclerosis ya establecida en humanos, de ningún modo invalidan el papel del estrés oxidativo en la biología vascular. El beneficio terapéutico en la población infantil afectada por HF puede ser muy diferente del obtenido en las personas mayores con la aterosclerosis ya establecida. En este punto, debemos mencionar un trabajo reciente en el que se analizan 9 cohortes, y que indica que las vitaminas antioxidantes, especialmente la vitamina C, tienen, de hecho, un efecto protector beneficioso 20.
Los mecanismos precisos que gobiernan los efectos beneficiosos de las vitaminas antioxidantes no están del todo claros. Los antioxidantes pueden proteger del estrés oxidativo a través de la conservación del NO mediante la eliminación de especies oxigenadas reactivas y la inhibición de la formación de LDL oxidadas 21. Así mismo, la combinación de vitaminas C y E protege las células endoteliales del efecto citotóxico de LDL oxidado 22. Aunque la disfunción endotelial, un signo precoz de aterosclerosis, no ha sido medida directamente 23, creemos que los cambios observados en la composición de los ácidos grasos plasmáticos, con el incremento de ácido linoleico y el descenso de ácido Mead y la relación Mead/araquidónico, pueden predecir una posible mejoría. Esto puede ser debido a una menor desviación del ácido araquidónico hacia productos proinflamatorios, como las prostaglandinas, con el resultado de una mayor disponibilidad del NO derivado del endotelio, y una mejoría secundaria en la distensibilidad vascular 24. La dosis de las vitaminas antioxidantes en el presente estudio fue idéntica a la recomendada por Engler et al 11, por lo tanto es probable que, si se les midiera, nuestros pacientes además presentarían una marcada mejoría en la distensibilidad vascular, un signo temprano comúnmente aceptado de arteriosclerosis en niños 25.
Aunque la HF es una alteración monogénica, la mortalidad varía enormemente entre los pacientes adultos afectados 26. Factores de riesgo adicionales de enfermedad cardiovascular genéticos y ambientales pueden determinar la variable expresión de la enfermedad observada, y la identificación de estos factores podría conducir a una intervención más eficaz a una edad temprana. En este sentido, en un estudio de cohorte, se ha demostrado que el tabaco es el factor más relevante para predecir la aparición de daño cardiovascular en pacientes adultos con HF.
La concentración plasmática de c-LDL todavía representa el mayor parámetro biológico que indica que la intervención farmacológica debe comenzar 27, pero todavía no está claro a qué edad debe ser comenzada la terapia con estatinas en niños afectados de HF.
Se ha indicado que los pacientes pueden ser tratados con seguridad a partir de 10 años en adelante 28. Sin embargo, como los niños prepuberales con HF presentan ya disfunción endotelial a la edad de 5 años, el grosor de la íntima arterial es ya mayor de lo normal desde los 12 años 29, el comienzo de la terapia antes de los 10 años debe ser debatida y considerada. ¿Podría tener el tratamiento temprano con vitaminas antioxidantes un papel en la prevención y progresión cuando se administran en la fase inicial de la aterosclerosis? Según los datos presentados el beneficio parece limitado, probablemente la determinación de marcadores de más sensibilidad como los valores de CD40 pueden ser necesarios para contestar esta cuestión definitivamente.
En resumen, los resultados del ensayo aleatorizado ciego único sobre los efectos de las vitaminas antioxidantes en niños con HF muestran que esta terapia es seguida por un incremento de los valores plasmáticos de ácido linoleico y un descenso en el cociente ácido Mead/araquidónico, modificaciones del perfil de ácidos grasos que son independientes del grado de dislipemia y pueden ser indicadores relevantes de un menor riesgo cardiovascular. Sin embargo, la utilidad de la terapia con vitaminas antioxidantes a largo plazo en estos niños sigue sin estar determinada.
Agradecimientos
Este estudio ha sido financiado por el Gobierno Vasco (exp 20001101) y el Instituto de Salud Carlos III (Red Redemeth exp FIS C03/054).
Correspondencia: Dr. L. Aldámiz-Echevarría.
Departamento de Pediatría. Hospital de Cruces.
Pl. de Cruces, s/n. 48903 Baracaldo. España.
Correo electrónico: kaldamiz@hcru.osakidetza.net
Recibido en abril de 2006.
Aceptado para su publicación en mayo de 2006.
